برگشتن به دامپزشکی

دانلود پایان نامه دکتری : مروري بر روشهاي ويروس شناسي «تخم مرغ جنين دار، كشت سلول، Elisa، HI، PCR»

۶,۰۰۰ تومان

Continue Shopping
دسته: برچسب: , , , , , , , , , , , , ,

توضیحات

دانلود پایان نامه دکتری : مروري بر روشهاي ويروس شناسي «تخم مرغ جنين دار، كشت سلول، Elisa، HI، PCR»

110ص

 

مقدمه

تعداد زيادي از بيماريهاي انسان، حيوان و گياه با وجود اينكه واگير و قابل انتقالند توسط باكتريها، قارچها، پروتزوئرها و به طور كلي توسط عواملي ايجاد مي شود كه نمي توان آنها را با ميكروسكوپ عادي ديد، و عفوني بودن اينگونه بيماريها را مي‌توان با تزريق مواد آلوده ويا پاليده آنها به دامهاي حساس به اثبات رسانيد.

ويروسها ازجمله كوچكترين عوامل عفوني مي باشند كه به علت دارا بودن خصوصيات مختص خود با ساير موجودات زنده تفاوت دارند. ويروسها را نمي توان درمحيطهاي مصنوعي آزمايشگاهي به راحتي تشخيص داد و بمنظور كشت، جداسازي و نهايتاَ شناسائي آنها از حيوانات حساس، تخم مرغ جنين دار و كشت سلول استفاده مي شود. در اثر استفاده از تخم مرغ جنين دار براي كشت ويروسها پيشرفت قابل ملاحظه اي درراه شناسايي و جداسازي اين عوامل عفوني حاصل شده است.

بيشتر ويروسها به ميزبان ويژه اي اختصاص دارند به نحوي كه دربدن ميزبان اختصاصي نيز، بافت و يا سلولهاي ويژه اي را جهت تكثير و بقاي خود انتخاب مي‌كنند. با توجه به دارا بودن چنين شرايط انحصاري دراين دسته ازميكروارگانيسمهاي عفوني مي توان بااستفاده از روشهاي مخصوص و تكنيكهاي مناسب تعداد زيادي از ويروسها را به رشد دربافت ميزبان ديگر عادت داد.

نظر به اينكه ياخته ها و پرده هاي غشائي اطراف جنين مرغ مانند بيشتر بافتهاي جنين فعاليتهاي اختصاصي دقيقي ندارند رشد و تكثير تعداد زيادي از ويروسها درآنها امكان پذير مي باشد.

تخم‌هاي مرغ‌هاي جنين دار كه درمراحل گوناگون رشد مي باشند با بكارگيري روشهاي مختلفي مي توان درآنها تلقيح نمود بعد از تلقيح تخم مرغها را درشرايط مناسب نگهداري نموده و هر روز بررسي مي نمايند. روشهاي استانداردي جهت تلقيح ويروسهاي مختلف به غشاء كوريوآلانتوئيك، كيسه آمنيوتيك، كيسه آلانتوئيك، كيسه زرده يا جنين، داخل مغز جنين و داخل عضلاني موجود است. مايع يا بافتهاي آنها را پس مدت زمان برداشته و تكثير ويروس يا آسيب‌هاي ناشي از آن رابررسي مي‌كنند.

واكنش بين ويروس وميزبان خيلي اختصاصي بوده و از نظر بيولوژي ويروسها، بازتاب تنوع سلولهاي ميزبان آنها مي باشد. تنوع دربين ويروسها به روشهاي گوناگوني كه ويروسها براي تكثير و باقي ماندن ازخود نشان مي دهند بستگي دارد.

درزمينه كشت ويروسها نيز قدمهاي مهم و با ارزشي برداشته شده است تلقيح به تخم مرغ يا استفاده از كشت سلول كه به ترتيب توسط ودروف (Woodruff) و پاركر (Parker) انجام پذيرفت ازمفيدترين روشهاست كه براي رشد ويروسها به كاررفته است و درحال حاضر در آزمايشگاههاي ويروس شناسي مورد استفاده مي باشد پيشرفتهايي كه درزمينه علوم بيوفيزيك، بيوشيمي، ايمني شناسي و ژنتيك حاصل شده، به شناخت ماهيت ويروسها كمك قابل توجهي كرده است. استفاده از دستگاههايي نظير ميكروسكوپ الكتروني، اولتراسانتريفوژ، ميكروسكوپ فلورسنت و اولترافيلتر درپيشبرد ويروس شناسي بسيار موثربوده است.

روشهاي مختلف تشخيص آزمايشگاهي بيماريهاي ويروسي برسه اصل استوار است

  1. جداسازي ويروس
  2. روشهاي سرمي
  3. روشهاي ملكولي

 

1-1 جداسازي ويروس

براي كشت و جداكردن ويروسها معمولاً ازحيوانات حساس، تخم مرغ جنين دار ويا كشت سلول استفاده مي شود. نمونه هاي مايع را كه عاري از باكتري باشند مي توان مستقيماً و يا پس از رقيق كردن به محيط زنده تلقيح نمود. نمونه هاي جامد را بايد درمحلول تامپون به نسبت 20-10 درصد به صورت تعليق درآورد. سپس توسط سانتريفوژبا دوركم ذرات معلق راجدا ساخت و مايع را دوباره سانتريفوژ كرده  و سپس اقدام به كشت نمود.

1- ا- الف-كشت درتخم مرغ جنين دار

دراثر استفاده از تخم مرغ جنين دار براي كشت ويروسها پيشرفت قابل ملاحظه اي درراه شناسايي و جداسازي اين عوامل بوجود آمده است. نظر به اينكه بافت ها و پرده هاي غشايي اطراف جنين مرغ مانند بيشتر بافتهاي جنين فعاليتهاي اختصاصي دقيقي ندارند، رشد تعداد زيادي از ويروسها درآنها امكان پذير مي باشد.

1-1- ب – جداكردن دركشت سلول

پيشرفتهاي حاصل دركشت سلول وسيله با ارزشي براي جداسازي و تكثير ويروسها در اختيار ويروس شناسان قرارداده است. ازدياد ويروس دركشت سلول را مي توان به روشهاي مختلف ازقبيل اثر بيماري زائي درسلول(CPE) تداخل ويروسها(Interference)، جذب گلبولهاي قرمز به ياخته هاي حاوي ويروس (Hemadsorption) هماگلوتنيشن(HA)، جستجوي آنتي ژن توسط ايمونوفلورسنت و يا ثبوت مكمل (CFT) تشخيص داد.

1-1-ج – كشت و جداكردن ويروس درحيوانات

انتخاب حيوان حساس براي جداكردن ويروس نكته اصلي دراين روش است كه دراين رابطه فاكتورهاي ضروري زيررا مي بايست درنظر گرفت.

1-سن حيوان

2-ميزبان طبيعي ويروس

3-منشأ حيوان

درحال حاضر ازاين روش به ندرت استفاده مي شود و بيشتر دربررسيهاي ويروس شناسي كاربرد دارد.

2-1- تشخيص بيماريهاي ويروسي توسط آزمايشهاي سرمي

عفونتهاي ويروسي معمولاً با واكنشهاي ايمني هومورال و سلولي همراه است، بنابراين سنجش هر يك ازآنها وسيله اي براي تشخيص بيماري مي باشد.

ازجمله آزمايشات سرمي متداول مي توان به موارد زير اشاره كرد:

1-آزمايشهاي خنثي سازي(NT)

2-واكنش ثبوت مكمل (CFT)

3-واكنش جلوگيري از جمع شدن گلبولهاي قرمز(HI)

4-واكنش ايموديفوژن (I D)

5-واكنش ايمونوفلورسنس (FA)

6-آزمايش ELLSA

3-1- شناسايي بيماريهاي ويروسي توسط آزمايشات ملكولي

تاريخچه تلقيح به تخم مرغ جنين دار

اولين بار دانشمندي به نام Good Pasture درسال 1913 به اين فكر افتاد كه عوامل عفوني را داخل تخم مرغ  جنين دار كشت دهد تلاش براي ابداع اين روش تا سال 1930 به طول انجاميد. بخش عمده اي از ويروسهاي حيواني وانساني را مي توان به طور مستقيم و يا پس از عادت دادن درقسمتهاي مختلف تخم مرغ جنين دارد تكثير نمود. وسايل كار نسبتاً ساده بوده و مهارت لازم دراين زمينه را مي توان درمدت زماني معقول فراگرفت. امروزه بخش وسيعي از واكسنهاي حيواني و انساني و بيش از 90 درصد واكسنهاي طيور با اين روش تهيه مي گردد.

2-1- محاسن استفاده ازتخم مرغ جنين دار

1-دردسترس بودن تخم مرغ نطفه دار و روش انكوباسيون آسان آن

2-امكان انجام تزريق دربخشهاي مختلف تخم مرغ جنين دار

3-عمل تلقيح ويروس حتي در آزمايشگاههاي با امكانات كم در شرايط مناسب قابل اجراست.

4-امكان نفوذ آلودگي ازخارج به داخل تخم مرغ بسيار كم است.

5-ميزان تكثير ويروس درداخل تخم مرغ جنين دار معمولاً زياد است.

2-2 منبع تهيه تخم مرغ

منبع تهيه تخم مرغ براي كارهاي دقيق ويروسي و توليد واكسن، گله هاي SPF      مي‌باشد ولي براي كارهاي روتين مي توان از گله هاي مادر پاك با مديريت خوب استفاده نمود. بايد توجه داشت كه تخم مرغ  جنين دار ممكن است حامل عوامل ميكروبي و ويروسي مانند سالمونلا، مايكوپلاسما، انسفالوميليت، لكوز طيور، نيوكاسل، هپاتيت ويروسي و غيره باشد.

بهتر است تخم مرغ نطفه دار را بلافاصله درانكوباتور مخصوص قرارداده تا جنين رشد كرده و درسن مطلوب مورد تزريق قرارگيرد. اما مي توان آنرا به مدت 5 الي 6 روز به طور مطلوب در 18-15 درجه و درصورت لزوم 15 الي 20 روز در 12 درجه سانتيگراد توأم با كاهش احتمالي ميزان باروري نگهداري نمود. بديهي است وجود اطلاعاتي درمورد گله توليد كننده ازقبيل برنامه واكسيناسيون، عيار آنتي بادي، بيماري هاي گله و داروهاي مورد استفاده درقبل يا درهنگام توليد براي ويروس شناس بسيار مفيد خواهد بود. آگاه بودن از آلودگي ويروسي و عيار آنتي بادي باعث مي شود كه تزريق با دقت كافي ودرمحل مناسب صورت پذيرد  به فرض مثال در آلودگي با نيوكاسل نبايد تزريق را دركيسه زرده انجام دهيم.

معمولاً تخم مرغ نطفه دار درماشين جوجه كشي كه قبلاً ضدعفوني شده دردرجه حرارت و رطوبت مناسب قرار مي گيرد تا رشد كند. ازانكوباتورهاي معمولي نيز    مي‌توان استفاده نمود. به اين ترتيب كه درجه حرارت 5/37 الي 38 و رطوبت 40 الي 70 درصد را تأمين نموده و تخم مرغها را روزي دوبار و ترجيحاً چهار بار با دست بچرخانيم. بعد از 5-3 روز اولين كندلينگ براي بررسي باروري تخم مرغ صورت گيرد دراين مرحله تخم مرغهاي بدون جنين و يا داراي جنين مرده حذف شوند.

در 5-3 روزگي فقط آثار عروق خوني مشاهده مي شود.

كندلينگ براي بار دوم قبل از تلقيح، بسته به نوع ويروس و راه تزريق درروزهاي 8 و 10 و 11و 12 صورت مي گيرد. بعد از تزريق محل تلقيح مسدود و تخم مرغها را به طور ثابت در همان درجه حرارت يا كمي پايين تر به مدت 2 الي 9 روز بسته به نوع ويروس قرار مي گيرند. بايد توجه داشت كه تمام اجزاي جنين تخم مرغ عفوني تلقي مي‌گردد و به هنگام بازكردن نبايد ازدريل يا ديسك كاربوراندوم استفاده كرد زيرا ايجاد ائروسل مي‌نمايد و بهتر است از پنس وقيچي استفاده نمود و عمليات مربوطه درزير هود ميكروبيولوژي انجام پذيرد.

البته پس از برداشت تخم مرغها آنها را به مدت 6-4 ساعت در 4 درجه سانيگراد قرار مي دهيم. اين عمل به منظور انقباض عروق و توقف جريان خون و به حداقل رساندن خونريزي درهنگام صورت مي پذيرد سپس محتويات تخم مرغ به منظور بررسي حضور ويروس مورد بازرسي قرار مي گيرد.

3-2 علائم رشد ويروس

برخي ويروسها تغييرات مورفولوژيكي بوجود مي آورند درحالي كه برخي ديگر باعث مرگ جنين و يا توليد هماگلوتينين ها مي گردند. بايد توجه داشت كه جابجائي خشن و تزريق نامناسب و آلودگي باكتريائي مي تواند موجب مرگ سريع جنين شود كه درهمه موارد توأم با بوي گنديدگي نخواهد بود. و درموارد مشكوك بايد كشت باكتريائي صورت گيرد.

4-2 ساختمان تخم مرغ  جنين دارد

1-زرده: حاوي مواد غذايي از قبيل 48 درصد آب –5/17 درصد پروئين –5/32 درصد چربي –يك درصد كربوهيدرات – يك درصد املاح

2-كيسه زرده: باترشح آنزيمهائي محتويات زرده را به صورت محلول درآورده و براي جنين قابل استفاده مي كند.

3-آمنيون: (مايع و غشاء) كيسه آمنيوتيك حاوي مايع آلبوميني به نام مايع آمنيوتيك مي باشد كه جنين درآن شناور مي باشد.

4-الانتوئيس: شامل غشاء و مايع الانتوئيك مي باشد. پرده الانتوئيك به عنوان سيستم گردش خون عمل مي كند و وقتي كاملاً رشد كرد اطراف جنين را فراگرفته و آنرا احاطه مي كند. پرده الانتوئيك ازروز سوم جنين شروع به تشكيل كرده و تا روز 12 تكميل مي شود.

اعمال غشاء الانتوئيك شامل:

الف-تنفس: بوسيله جريان خون اكسيژن به جنين رسانده ودي اكسيد كربن آنرا    مي‌گيرد.

ب-دفع: اين غشاء مواد دفعي حاصل ازعمل تصفيه كليوي جنين را گرفته و درحفره الانتوئيك مي‌ريزد.

ج-گوارش: به هضم آلبومين و جذب كلسيم ازپوسته تخم مرغ كمك مي كند.

5-غشاء زير پوسته آهكي:

اين غشا نقش فيزيولوژيك با اهميتي ندارد.

6-پوسته آهكي:

اين پوسته ازخارج بوسيله لايه نازك كوتيكول پوشيده شده و عمدتاً ازكربنات كلسيم تشكيل شده است. كوتيكول سد محافظتي دربرابر عبور اجرام عفوني ايجاد مي كند.

5-2 رشد جنين درسنين مختلف

درروز اول و دوم آثار بسيار ظريف عروق خوني قابل مشاهده است.

در روز سوم عروق خوني قابل مشاهده بوده و ممكن است جنين به صورت لكه كوچكي مشاهده شود.

درروز پنجم عروق خوني گسترش يافته و جنين قابل مشاهده مي باشد.

ازروز هشتم به بعد موقعيت  فضاي آمينوتيك قابل تشخيص و تعيين است و درروز 14 به بعد جنين به صورت توده ديده مي شود.

درروز 20-19 اطاقك هوائي مشاهده نمي شود.

6-2 راههاي تزريق

داخل زرده : ازتخم مرغ 5 الي 7 روزه به منظور جداسازي، بلوتانگ-هاري-كلاميديا

مايع آمنيوتيك: ازتخم مرغ 10 الي 12 روزه به منظور جداسازي آنفلونزاي تيپ     A و B

مايع الانتوئيك: ازتخم مرغ 9 الي 11 روزه به منظور جداسازي نيوكاسل.

پرده كوريولانتوئيك: ازتخم مرغ 10 الي 12  روزه به منظور جداسازي ويروس آبله.

داخل وريدي: ازتخم مرغ 11 الي 13 روزه به منظور جداسازي ويروس بلوتانگ وآربوويروسها.

داخل مغز جنين: درتخم مرغ 12 روزه به منظور جداسازي ويروس آنسفاليت.

داخل عضلاني:

7-2 موارد استعمال تخم مرغ جنين دار SPF درتشخيص ويروسها

الف-ويروسهائي كه درتمام قسمتهاي تخم مرغ جنين دار رشد مي كنند.

1-طاعون مرغي

2-نيوكاسل

3-آنسفاليت اسب

ب-ويروسهائي كه روي پرده كوريوالانتوئيك رشد كرده و ايجاد جراحات شديد      مي كنند.

1-آبله طيور

2-نيوكاسل

3-لارنگوتراكئيت

4-واكسين

5-آبله انسان

6-هرپس سيمپلكس

7-ميكزوماي خرگوش

ج-ويروسهائي كه روي پرده كوريولاانتوئيك رشد كرده و ايجاد جراحات مختصر       مي كنند.

1-آنفلوانزاي Aو B

2-لنفوگرانولوماتوز

3-لوپينگ ايل

4-ويروس بيماري كاره

5-سرخجه

د-ويروسهاي كه درروي پرده كوريوالانتوئيك رشد كرده و ايجاد جراحت        نمي‌كنند.

1-هاري

2-سرخك

3-سرخجه

4-برونشيت عفوني

ه-ويروسهائي كه درحفره الانتوئيك رشد مي كنند.

1-گريپ A و B

2-سويه نوروتروپيك گريپ

3-پارا آنفوآنزا

4-طاعون مرغي

5-نيوكاسل

6-اوريون

7-پوليوميليت تيپ II

و-ويروسهائي كه درحفره آمنيوتيك رشد مي كنند .

1-گريپ A و D و C

2-گريپ نورروتروپيك

3-پاراآنفلوانزا

4-نيوكاسل

5-اريون

6-گرانولوماتوزعفوني

ي ويروسهائي كه دركيسه زرده رشد مي كنند.

1-گريپ A و B

2-آنفلوآنزاي A و B

3-هرپس سيمپلكس

4-لنفوگرانولوماتوزعفوني

5-اريون

6-هاري

7-آربوويروسها

8-پارا انفلانزا

8-2- روشهاي مختلف كشت عوامل ويروسي درتخم مرغ جنين دار SPF

مقدمات تزريق

مكان تزريق بايد به چراغ اولتراويوله مجهز باشد وعمل تزريق درشرايط كاملاً بهداشتي حتي الامكان استريل انجام گيرد.

وسايل موردنياز شامل

  • سيني حمل تخم مرغ
  • محلول الكل يده (تنتوريد)
  • پنسهاي كوچك و متوسط
  • قيچيهاي متوسط با نوك تيز و گرد
  • سرنگ و سرسوزن دراندازه هاي مختلف
  • دريل و ديسك مناسب جهت سوراخ كردن پوسته
  • پارافين
  • انواع پيپت و پيپت پاستور

9-2 روش تزريق درحفره الانتوئيك

عمدتاً درتخم مرغ 11-9 روزه صورت مي‌گيرد و به دو روش امكان پذير است.

روش اول

1)تخم مرغ را كندلينگ ودرصورت مشخص بودن عروق وزنده بودن جنين موقعيت آنرا همراه با مرز اطاقك هوائي درروي پوسته آهكي مشخص مي كنيم.

2) تخم مرغ را به آرامي و به طور عمودي درسيني آن قرار مي دهيم به نحوي كه اطاقك هوائي روبه بالا باشد.

3) ناحيه اي از پوسته روي اطاقك هوائي را درطرف مقابل محل علامت گذاري شده (سمتي كه دور از جنين قراردارد) 2 الي 3 ميلي متر بالاتر از مرز اطاقك هوائي انتخاب نموده وبا محلول تنتوريد ضد عفوني مي كنيم.

4)به كمك دريل و ديسك كاربر‌اندوم محل ضدغفوني شده را طوري شكاف مي دهيم كه به غشاء زير پوسته آسيبي وارد نشود.

5) به كمك سرنگ انسولين متصل به يك سرسوزن به طول 5/1 سانتي متر 1/0 الي 2/0 سي سي از نمونه ويروسي به طور عمودي و به آرامي تزريق مي گردد.

6) با كمك پارافين مذاب (دو قسمت پارافين پاتولوژي + يك قسمت وازلين) استريل محل تزريق به طور موضعي مسدود مي گردد و تخم مرغ به طور ثابت و بدون حركت درانكوباتور قرار مي‌گيرد.

روش دوم

1-پس از اطمينان از زنده بودن جنين به هنگام كندلينگ درهمان حالت درنقطه مقابل جنين و درروي پوسته آهكي درمنطقه بين رگهاي خوني (فاقد رگ خوني) و پايين تر از اطاقك هوائي علامت گذاري صورت مي گيرد.

2-تخم مرغ به همان حالت افقي و به آرامي برروي سيني مخصوص قرارداده شده و ناحيه علامت گذاري شده ضد عفوني مي گردد.

3-به كمك دريل و ديسك منطقه ضد عفوني شده بدون آسيب رساندن به غشاء زير پوسته شكافته مي شود.

4-با كمك يك سرسوزن بسيار ظريف (انسولين) و سرنگ انسولين به عمق نيم سانتي متر وارد فضاي الانتوئيك تخم مرغ گرديده و 1/0 الي 2/0 سي سي نمونه ويروسي به طور بسيار آهسته تزريق مي گردد. (براي جلوگيري از پس زدن آهسته تزريق مي شود.

5-باكمك پارافين محل تزريق مسدود گرديده و تخم مرغ به طول ثابت وبدون حركت به همان حالت افقي درانكوباتور قرار مي گيرد.

10-2 روش تزريق درحفره آمينوتيك

معمولاً تخم مرغ ها درسن 8 الي 11 روزه و 10 الي 12 روزه بسته به نوع ويروس مورد تزريق قرارمي گيرد. تزريق درحفره آمينوتيك به سه روش انجام مي شود.

روش اول

  • كندلينگ و تعيين موقعيت جنين و كيسه هوائي
  • ناحيه اي از پوسته درسمت جنين چند ميليمتربالاتر از مرز اطاقت هوائي       ضد‌عفوني مي شود.
  • تراش بوسيله دريل و ديسك
  • باسرسوزن به طول cm5/1 به طور عمودي ازمحل شكاف وارد فضاي آمنيوتيك شده و cc  1/0 ازنمونه ويروسي تزريق مي شود.
  • مسدود كردن سوراخ با پارافين و قراردادن درانكوباتور

روش دوم

  • كندلينگ نمودن تخم مرغ و تعيين موقعيت جنين
  • پوسته آهكي ناحيه اي كه جنين قراردارد را ضد عفوني كرده و بدون صدمه زدن به غشاء زير پوسته آهكي با كمك ديسك پوسته آهكي شكافته مي شود.
  • به كمك يك سرسوزن به طول cm 5/2 و قطر G 32 در حالي كه تخم مرغ به طور افقي روي چراغ كندلينگ قرار دارد عمل تزريق انجام مي شود. توجه گردد كه ورود سرسوزن به حفره آمنيوتيك باعث جابجا شدن جنين خواهد شد و اين  نشانه‌اي از تزريق درمكان صحيح مي‌باشد.
  • تزريق 1/0 الي 2/0 cc مايع ويروسي
  • قراردادن تخم مرغ بدون حركت درانكوباتور

روش سوم

  • كندلينگ و مرز اطاقك هوائي دورتا دورتخم مرغ مشخص مي گردد.
  • پوسته اطاقك هوائي را كاملاً ضد عفوني كرده و تخم مرغ به طور عمودي درسيني قرارداده مي شود به طوري كه اطاقك هوائي رو به بالا است.
  • به كمك دريل و ديسك 1-2mm بالاتر ازمرز اطاقك هوائي در دور تا دور تخم مرغ پوسته به طور كامل تراش داده مي شود و سپس پوسته اطاقك به طول كامل برداشته مي شود.
  • دراين حالت كف اطاقك هوائي كه شامل غشاء زير پوسته وغشاء كوريوالانتوئيك مي باشد ظاهر مي گردد.
  • چند قطره كوچك پارافين يا وازلين استريل و مذاب بركف اتاقك هوائي ريخته مي‌شود تا غشاء زير پوسته شفاف شود.
  • نوك يك پنس ظريف را به حالت بسته از ناحيه شفاف شده وارد كرده و درداخل تخم مرغ پس از رسيدن به غشاء آمنيوتيك پنس را بازكرده و به آرامي غشاء آمنيوتيك را گرفته و كمي به سمت بالا مي كشيم.
  • با كمك سرنگ و سرسوزن ظريف 1/0 الي 2/0 سي سي ازنمونه ويروسي تزريق مي گردد.
  • به آرامي كيسه آمنيوتيك را رها كرده و پوسته آهكي اتاقك هوائي را بوسيله پارافين درجاي خود مي چسبانيم و يا اينكه يك صفحه شيشه اي برروي تخم مرغ به كمك پارافين فيكس مي كنيم و تخم مرغ به همين حالت به طور عمودي و ثابت درانكوباتور قرار مي گيرد.

توجه: اين روش از ريسك بالائي برخوردار بوده و معمولاً استفاده نمي گردد.

11-2-تزريق در كيسه زرده

تزريق دركيسه زرده درروزهاي 5-3 و يا 7-5 صورت مي گيرد و به سه روش امكان پذير است.

روش اول

  • كندلينگ و تعيين موقعيت كيسه هوائي
  • ناحيه اي را دقيقاً درمركز غشاء آهكي اتاقك هوائي انتخاب مي كنيم.
  • بعد از ضد عفوني محل مورد نظر با كمك دريل بدون صدمه رساندن به غشاء زير پوسته در ناحيه مشخص شده شكاف ايجاد مي كنيم.
  • به كمك يك سرنگ انسولين و يك سرسوزن بلند به طول 4 سانتي متر ازمحل شكاف كيسه هوائي را شكافته و آنرا برمي داريم و به اين ترتيب وقتي كف اتاقك هوائي نمايان شد….

چند قطره پارافين و يا وازلين مذاب برروي غشاء زير پوسته به منظور شفاف شدن بريزيم.

  • به كمك پنس ازمحل شفاف شده درحالتي كه نوك پنس بسته است وارد فضاي تخم مرغ شده و پس از رسيدن به كيسه زرده دهانه پنس را به مقداركمي بازكرده و به آرامي كيسه زرده را مي گيريم. سپس كيسه زرده رابالا مي كشيم تا به خوبي دربرابرما ديده شود و دراين حالت تزريق مستقيماً به داخل كيسه زرده صورت مي گيرد. با اين روش مقدار تزريق مايع به مقدار زيادتر امكان پذير خواهد بودولي ازطرف ديگر ميزان مرگ و مير نيز زيادتر مي‌باشد.
  • دهانه تخم مرغ را به وسيله دوباره قراردادن پوسته قبلي و فيكس كردن آن با پارافين و يا مسدود كردن آن بوسيله يك صفحه شيشه اي ظريف و پارافين مي‌بنديم.
  • تخم مرغ را به حالت عمودي درداخل انكوباتور قرارمي‌دهيم.

روش دوم:

  • تخم مرغ جنين دار به سن 10 الي 12 روزه كندلينگ نموده و پس از اطمينان اززنده بودن جنين درنقطه مقابل آن روي بدنه تخم مرغ تقريباً 5/0 الي يك سانتي متر پايين تر از اطاقك به طور عمودي وارد فضاي كيسه زرده مي شويم و 1/0 سي سي از نمونه ويروسي را تزريق مي كنيم. بهتر است قبل از تزريق سرنگ را اسپيره كرده تا درصورت وارد شدن ضربه به داخل سرنگ ازقرارگرفتن صحيح سرسوزن درداخل كيسه زرده اطمينان حاصل گردد.

5-مسدودكردن محل تزريق با پارافين و قراردادن تخم مرغ در انكوباتور

روش سوم

  • كندلينگ و تعيين موقعيت جنين
  • قسمت مقابل، روي پوسته آهكي، منطقه اي كه فاقد رگهاي خوني و تقريباً درميانه تخم مرغ قرارگرفته باشد انتخاب مي شود.
  • محل مورد نظر را پس از ضد عفوني بوسيله دريل بدون آسيب رساندن به غشاء زيرپوسته شكاف مي دهيم.
  • با كمك يك سرسوزن به طول 2-3 سانتي متر و سرنگ انسولين درحالتي كه تخم مرغ به طور افقي روي سيني قراردارد و شكاف روبه بالا است (جنين درسمت پايين قراردارد) به طور عمودي وارد فضاي كيسه زرده مي شوئيم و 1/0 سي سي ازنمونه ويروسي درداخل زرده تزريق مي گردد.
  • محل تزريق بوسيله پارافين مسدود و تخم مرغ را درانكوباتور قرار مي دهيم.

روش تزريق روي غشاء كوريوالانتوئيك

عده اي از ويروسها مي توانند روي سلولهاي اكتودرمي غشاء كوريوالانتوئيك رشد كنند و اين رشد به صورت ضايعات و جراحات مختلف بروز مي‌كند كه ازنظر ماكروسكوپي و هم از نظر ميكروسكوپي ارزش تشخيص دارد.

روش كار

  • كندلينگ و قراردادن تخم مرغ به طور افقي درسيني و كندلينگ
  • پوسته آهكي را به طور كامل ضد عفوني كرده ناحيه اي كه داراي عروق خوني كمتر مي باشد انتخاب نموده و به شكل يك مثلث علامت گذاري مي كنيم و به كمك دريل شكاف ايجاد مي كنيم.
  • با يك پنس استريل به آرامي روي مثلث تراشيده شده فشار مي آوريم تا اتصالهاي احتمالي پوسته آهكي نيز شكسته شود البته لازم به توضيح است كه آن تكه از پوسته كه بريده شده بايد سالم بماند. سپس به آرامي پوسته مثلثي را ازغشاء زير پوسته جدا مي كنيم.
  • با كمك گرفتن يك وسيله نوك تيز(سرسوزن) با احتياط بسيار و درحالتي كه سرسوزن به طور موازي با محور تخم مرغ قراردارد سعي مي كنيم تا شكاف بسيار كوچكي درغشاء زير پوسته بوجود آوريم به نحوي كه به غشاء كوريوآلانتوئيك كه بلافاصله درزير آن قرارداردآسيبي نرسد. درصورت آسيب ديدن، غشاء كوريوالانتوئيك در آن خونريزي ظريف و بسيار كم به همراه آلودگي غشاء زير پوسته آهكي به خون مشخص خواهد شد.
  • به كمك يك وسيله مناسب از ناحيه اطاقك هوائي كه قبلاً درمركز آن سوراخي بوجود آورده ايم درهمان حالت كه تخم مرغ به طور افقي قراردارد به مقدارمناسبي مكش ايجاد مي كنيم. دراثر اين عمل محتويات داخل تخم مرغ درنتيجه تخليه هواي موجود دراطاقك هوائي به سمت اطاقك هوائي جابجا شده و خلاء نسبي درداخل تخم مرغ ايجاد شود كه درنتيجه اين خلاء كليه محتويات تخم مرغ و غشاء كوريوالانتوئيك درسراسر بدنه تخم مرغ تحت فشار خواهد گرفت و با توجه به اينكه درمراحل قبلي سوراخي درغشاء زير پوسته دربدنه تخم مرغ بوجود آورده هوا وارد فضاي زير پوسته گرديده و غشاء كوريولانتوئيك ازغشاء زير پوسته فاصله خواهد گرفت و پائين خواهد افتاد. بدين ترتيب اطاقك هوائي مصنوعي دربدنه تخم مرغ بوجود آورده ايم.
  • اكنون به كمك يك پيپت پاستور استريل و يا سرنگ و سرسوزن مي توان مايع ويروسي را به ميزان 1/0 و 2/0 سي سي در اتاقك هوائي مصنوعي تزريق نمود.
  • دراين مرحله پوسته آهكي مثلثي شكل را به دقت درجاي قبلي قرارداده و باكمك پارافين بر روي بدنه تخم مرغ فيكس مي كنيم و تخم مرغ ها را درانكوباتور قرار مي‌‌دهيم.

13-2-برداشت مايعات و غشاء هاي آلوده به ويروس ازتخم مرغ جنين دار تزريق شده

تذكر:تمامي اجزاي تخم مرغ تلقيح شده تحت هر شرايطي و صرف نظر از اينكه احتمالاً تزريق موفقيت آميز بوده يا نه مي بايست شديداً عفوني تلقي گردد و تمامي احتياطات ازنقطه نظر رعايت موارد بهداشتي و استريل بودن شرايط كار و عدم ايجاد آلودگي دررابطه با خودمد نظر قرارگيرد.

تخم مرغ را درسيني مخصوص قرار مي دهيم.

پس از ضدعفوني پوسته آهكي درمحل اطاقك هوائي با كمك پنس و قيچي استريل پوسته قسمت مورد نظر را برمي داريم به نحوي كه به غشاء زير پوسته دركف اطاقك هوائي صدمه اي وارد نشود.

با كمك نوك سرسوزن غشاء زير پوسته و همچنين غشاء كوريولانتوئيك را درسمتي كه جنين است پاره مي كنيم به طوري كه خونريزي ايجاد نشود. سپس غشاء ها را به آرامي كنار زده به اين ترتيب مايع الانتوئيك نمايان مي‌گردد.

براي برداشت مايع آمنيوتيك مايع الانتوئيك راخارج تا كيسه آمنيوتيك مشاهده و اقدام به برداشت مي نماييم.

براي برداشت غشاء كوريوالانتوئيك محتويات تخم مرغ را خارج و غشاء به همان حالت كه درداخل پوسته تخم مرغ قراردارد با سرم فيزيولوژيك شسته شده و به كمك پنس به يك ظرف منتقل و مورد بررسي قرارمي گيرد.

تذكر: قبل از برداشت مايع ازتخم مرغ آنرا حداقل به مدت 6 ساعت در 4 درجه سانتي گراد قرارمي دهيم تا عروق خوني منقبض شود ودرهنگام كار خونريزي به حداقل برسد.

 

.

.

-«ممانعت از هم اگلاتيناسيون»

اين روش براي شناسايي ويروس هايي كه مي توانند گلبول هاي قرمز حيوانات مختلف مانند مرغ- خوكچه هندي و انسان- را الگوتينه كند، تستي انتخابي مي‌باشد

آنتي بادي موجود در سرم موجب مي‌شود كه مقدار استانداردي از ويروس نتواند به گلبول قرمز متصل شده و آنرا الگوتينه كند.

برخي از ويروس ها مثل هاري سرخجه به طور مستقيم باعث الگوتيناسيون گلبولهاي قرمز بز و پرندگان مي گردند، حال اگر پس از رقيق نمودن سرم بيمار رقت ثابتي انتي ژن «سرخجه» به تركيب حاصل اضافه گردد در صورتي كه بيمار مبتلا به سرخجه باشد انتي باديهاي ضد سرخجه نيز در سرم وي وجود خواهد داشت.

حال در صورتي كه گلبولهاي قرمزي مثل «گلبول هاي قرمز پرنده براي ويروس سرخجه» به ميزان معين به مواد فوق اضافه گردد در صورت مثبت بودن تست در حفره ها «يعني وجود انتي بادي در سرم شخص» بواسطة خنثي كردن انتي ژن توسط انتي بادي هم اگلاتيناسيون اتفاق نخواهد افتاد و در صورت منفي بودن تست در تمام حفره ها هم الگوتيناسيون خواهيم داشت، آزمايش HI در حال حاضر براي ويروس هايي مثل انفلانزا B , A كاربرد دارد.

اين آزمايش در دو مرحله انجام مي‌شود با اين آزمايش انتي بادي ضد يك ويروس را در سرم تشخيص مي دهند.

نكاتي در مورد الگاتيناسيون گلبول قرمز توسط ذرات ويروسي:

  • تمام ويروس ها قادر به الگوتينه RBC نيستند.
  • ويروس ها به طور انتخابي RBC را الگوتينه مي‌كنند.

ويروس سرخجه RBC پرندگان مثل كبوتر و جوجه را الگوتينه مي‌كند.

انفلانزا و پارا انفلانزا گلبول قرمز خوكچة هندي، جوجه و انسان را الگوتينه مي‌كند.

آزمون HI يك روش سرولوژي براي تشخيص انتي بادي ضد سرخجه در سرم مي باشد. كه در زير روش انجام اين آزمايش شرح داده شده است.

روش آزمايش:

مواد لازم: دكستروز- سيترات سديم- اسيد سيتريك- كلرور سديم- نمك طعام- ژلاتين- ورونال باربيتال- سديم  و رونال- كلرور كلسيم بدون آب- سولفات منيزيم با 7 مولكول آب، كائولن شسته شده با اسيد- انتي ژن سرخجه- كبوتر-

وسايل لازم: سرنگ 5 ميلي ليتر- ميكروپليت با حفره هاي V – لوپ- ميكروپليت با قطري با حجم ml 025/0 و ml 05/0- لوله هاي هموليز- لوله هاي آزمايش مندرج مخروطي شكل- پارا فيلم پيپتهاي 2 ميلي ليتري و 10 ميلي ليتري- پيپت پاستور.

بوسيله سرنگ و سوزن 19 از وريد ساعد دست به مقدار 4 ميلي ليتر خون مي گيريم پس از انعقاد خون در محيط، سرم آن با سانتريفيوژ 1200 دور در دقيقه به مدت 10 دقيقه جدا مي‌شود- و سرمها را ترجيحاً در 70- درجه تا روز آزمايش نگه مي‌داريم-

تهيه محلول السور

گلوكز            5/20 گرم

نيترات سديم      58/0 گرم

اسيد سيتريك      55/0 گرم

كلروسديم     20/4 گرم

آب مقطر      1000 ميلي ليتر

پس از حل كردن مواد، مخلوط را 5 دقيقه در اتوكلاو استريل كرده و در يخچال نگه مي داريم تا PH نهايي به 1/6 برسد.

تهيه گلبول قرمز كبوتر: با يك سرنگ استريل ml 5-2 از سياهرگ زير بال كبوتر خون مي گيريم و بلافاصله در لوله حاوي محلول السور «هم حجم خون» مي ريزيم- مي توان از ابتدا چند ميلي ليتر محلول السور  به درون سرنگ كشيده و با همان سرنگ خونگيري كرد- محلول السور  اثر ضد انعقادي و نگهدارنده دارد و مي‌تواند گلبولهاي قرمز را براي 5-10 روز حفظ كند- ابتدا مقداري از RBC كه در محلول السور  است در يك لوله آزمايش ريخته و به آن مقداري بافر والسور – ژلاتين- ورونال (DG-V) اضافه كرده و به 15 دقيقه در 1200 دور سانتريفيوژ مي كنيم سپس مايع روي آنرا با پليپت پاستور دور ريخته و به رسوب حاصل مجدداً بافر اضافه مي‌كنيم- پس از تعليق گلبولها آنرا دوباره سانتريفيوژ مي كنيم عمل شستن گلبولها را سه بار تكرار مي كنيم در پايان از رسوب RBC سوسپانسيون 50/0 و 25/0 در اين بافر تهيه مي كنيم.


روش انجام آزمايش:

ابتدا دو رديف 12 تايي ميكروپليت V را براي آزمايش انتخاب مي كنيم كه يك رديف براي كنترل گلبول قرمز و ديگري براي تعيين تيتراژ آنتي ژن مي باشد.

  • مقدار 025/0 ميلي ليتر بافر DGV با ميكروپيپت از حفره دوم تا 12 ريخته و در حفره اول 05/0 ميلي ليتر آنتي ژن مي ريزيم.
  • با لوب 025/0 ميلي ليتر از حفره اول به دوم برده تا آخرين حفره به ترتيب اين كار ادامه مي دهيم تا رقت و سريال 2 4   8   16  32   …

تهيه شود.

  • به تمام حفره ها 0250/ ميلي ليتر بافر DGV اضافه گردد تا حجم حفره ها مساوي 05/0 ميلي ليتر شود.
  • به تمام حفره ها 05/0 ميلي ليتر از سوسپانسيون گلبول قرمز كبوتر 25/0% درصد رقت (400 : 1) مي ريزيم.
  • مدت يك ساعت ميكروپليت ها را در يخچال 4 درجه قرار داده و نتيجه را مي‌خوانيم- آخرين حفره اي كه هماگلوتيناسيون RBC ديده شود معادل يك واحد هماگلوتيناسيون آنتي ژن سرخجه مي باشد. با در نظر گرفتن سريال ميكروپليت دو حفره ماقبل آن «به طرف آنتي ژن خالص حاوي 4 واحد آنتي ژن است «اگر هماگلوتيناسيون نباشد حالت نگين خواهيم داشت»

اگر عيار آنتي ژن 128 : 1 باشد يعني آخرين حفره اي كه هماگلوتيناسيون مشاهده داراي رقت 128: 1 باشد دو حفره قبل از آن يعني 32 : 1 معادل 4 واحد آنتي ژن است بنابراين بايد آنتي ژن را به نسبت 32: 1 با بافر D.G.V  رقيق كرد «يك ميلي ليتر آنتي ژن خالص با 31 ميلي ليتر بافر DGV» و در آزمايش وقفه هماگلوتيناسيون بكار برد.

قبل از مراحل وقفه HI مراحل آماده كردن سرم به ترتيب زير انجام مي‌شود.

  • با پيپت 2 ميلي ليتري مقدار 4/0 ميلي ليتر بافر G.V را در لوله هاي هموليز مي‌ريزيم.
  • 1/0 ميلي ليتر سرم شخص مورد نظر را به آن اضافه مي كنيم.
  • 5/0 ميلي ليتر كائولين 25/0 شسته با اسيد را به منظور جذب ممانعت كننده هاي غيراختصاصي بتاليپوپروتئين سرم به آن اضافه مي كنيم.
  • لوله ها را نيم ساعت در حرارت آزمايشگاه قرار داده و در طول اين مدت گاهي به ملايمت لوله ها را تكان مي دهيم.
  • بعد از اين مدت لوله ها با دور 2000 بيست دقيقه در 4 درجه قرار مي دهيم.
  • 05/0 ميلي ليتر گلبول قرمز كبوتر 50 درصد به منظور جذب هماگلوتينهاي غيراختصاصي به لوله ها اضافه مي كنيم.
  • يك ساعت لوله ها را در يخچال 4 دربه مي گذاريم و گاهي به ملايمت آنها را تكان مي‌دهيم.
  • لوله ها را به مدت 20 دقيقه با دور 2000 در 4 درجه سانتريفيوژ مي كنيم.
  • مايع رويي را به لوله ديگر منتقل كرده و اين سرم جذب شده به 5/0 ساعت در بن ماري 56 درجه گذاشته تا كمپلمان آن غيرفعال شود.

رقت اين سرم جذب شده در اين مرحله برابر 10: 1 مي باشد سرم آماده شده را گاهي اوقات تا روز بعد براي آزمايش مي توان در يخچال نگه داشت.

آزمايش HI :

  • ابتدا در حفره اول و آخر يك رديف ميكروپليت V مقدار 05/0 ميلي ليتر سرم آماده شد مي ريزيم حفره آخر بعنوان كنترل سوم است.
  • در حفره هاي مابين اول و آخر مقدار 025/0 ميلي ليتر بافر G.V مي ريزيم.
  • بالوپ 025/0 از حفره اول تا يكي مانده به آخر سرم را به طور سري رقيق مي كنيم. در حفره اول رقت سرم 10: 1 و در حفره دوم 20: 1 و در آخرين حفره ماقبل آخر كه سرم رقيق شده 128: 1 مي باشد.
  • به تمام حفره ها غير از حفره آخر مقدار 025/0 از محلول آنتي ژن سرخجه كه حاوي 4 واحد هماگلوتيناسيون مي باشد اضافه مي كنيم.
  • پليت را 5/0 ساعت در يخچال 4 درجه قرار مي دهيم تا واكنش آنتي ژن- آنتي بادي انجام گيرد.
  • پس از اين مدت به تمام حفره «حتي به آخري» مقدار 05/0 ميلي ليتر از سوسپانسيون 400: 1 گلبول قرمز كبوتر اضافه مي كنيم.
  • به مدت 5/0 ساعت پليتها را در 4 درجه قرار مي دهيم. بعد از اين مدت نتايج را مي خوانيم.

طرز خواندن نتايج:

آخرين رقتي كه از سرم باعث وقفه شده تيتر نهايي بادي موجود در سرم بيمار بر عليه سرخجه است.

تفسير: در اغلب اجتماعات مختلف عيار آنتي بادي ضد سرخجه برابر و يا كمتر از 8:1 بوسيله HI تعيين مي‌شود. به عنوان پايين ترين تيتر مؤثر بر عليه سرخجه مي‌دانند.

سطح حفاظتي انتي ضد سرخجه برابر با 15 واحد بين المللي در يك ميلي ليتر سرم يا معادل 10: 1 در HI مي باشد.

.

.

.

جهت دریافت و خرید متن کامل پایان نامه و تحقیق و مقاله مربوطه بر روی گزینه پرداخت مستقیم که در بالای صفحه قرار دارد کلیک نمایید و پس از وارد کردن مشخصات خود به درگاه بانک متصل شده که از طریق کلیه کارت هایی عضو شتاب قابل پرداخت می باشید و بلافاصله بعد از پرداخت انلاین به صورت خودکار لینک دانلود مربوطه فعال گردیده که قادر به دانلود فایل کامل ان می باشید.

دیدگاهها

هیچ دیدگاهی برای این محصول نوشته نشده است.

اولین نفری باشید که دیدگاهی را ارسال می کنید برای “دانلود پایان نامه دکتری : مروري بر روشهاي ويروس شناسي «تخم مرغ جنين دار، كشت سلول، Elisa، HI، PCR»”

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *